NY_T 2841-2015 猪传染性胃肠炎病毒RT-nPCR检测方法
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ID： |
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文件大小(MB)： |
0.54 |
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页数： |
10 |
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文件格式： |
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日期： |
2024-8-14 |
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ICS 11.220,B41 NY,中华人民共和国农业行业标准,NY/T 2841—2015,猪传染性胃肠炎病毒RT-nPCR检测方法,Method of detecting transmissible gastroenteritis virus by RT-nPCR,2015-10-09 发布 2015-12-01 实施,中华人民共和国农业部发布,NY/T 2841—2015,* * ^1—,刖 百,本标准按照GB/T 1. 1—2009给岀的规则起草,本标准由中华人民共和国农业部提出,本标准由全国动物卫生标准化技术委员会归ロ (SAC/TC 181),本标准起草单位:中国动物卫生与流行病学中心、东北农业大学、河南农业大学、河南牧业经济,学院,本标准起草人:邵卫星、魏荣、李晓成、李一经、黄耀华、魏战勇、徐耀辉、吴发兴、张志、刘爽、董亚琴、,孙映雪、李卫华、王树双、黄保续,I,NY/T 2841—2015,猪传染性胃肠炎病毒RT -nPCR检测方法,1范围,本标准规定了检测猪传染性胃肠炎病毒RT-nPCR方法的技术要求,本标准适用于检测疑似感染猪传染性胃肠炎病毒的猪的新鲜粪便、小肠组织及肠内容物和细胞培,养物中的猪传染性胃肠炎病毒的核酸,可作为猪传染性胃肠炎的辅助诊断方法和细胞培养物中猪传染,性胃肠炎病毒的鉴定,2规范性引用文件,下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文,件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件,GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法,3缩略语,下列缩略语适用于本文件:,AMV:禽成髓细胞瘤病毒 avian myeloblastosis virus,RT - nPCR:反转录ー巢式聚合酶链式反应 reverse transcriptase - nested polymerase chain reaction,RNA:核糖核酸 ribonucleic acid,DEPC:焦碳酸二乙酯 diethypyrocarbonate,PBS:磷酸盐缓冲液（配方见附录 A. 1） phosphate - buffered saline buffer,Taq 酶:Taq DNA 聚合酶 Taq DNA polymerase,dNTPs ：脱氧核糖核昔三磷酸 deoxyribonucleoside triphosphates,bp:碱基对 base pair,4试剂,除另有规定外,所用生化试剂均为分析纯,水为符合GB/T 6682的灭菌双蒸水或超纯水。提取,RNA所用试剂均须使用无RNA酶水配制,分装的容器需无RNA酶,4. 1磷酸盐缓冲液:配方见附录A. L,4.2 RNA 提取试剂:Trizol LSO,4.3 氯仿（警吿:危险,4.4 异丙醇,4.5 75%的乙醇,4. 6 DNA分子量标准:DL2 0000,4.7 AMV反转录酶及反应缓冲液,4. 8 dNTPs Mixture〇,4.9 RNA酶抑制剂（40 U/ル）,4. 10 rTaq mix0,4.1I反转录及PCR扩增引物:见附录B,1,NY/T 2841—2015,4. 12无RNA酶超纯水,4. 13 1.5%琼脂糖:配方见A. 3,4. 14电泳缓冲液(TAE):配方见A. 4,4. 15样品处理液:配方见A. 2,4. 16阳性样品:参见C. 1,4. 17阴性样品:参见C. 2,5仪器设备,5.!高速冷冻离心机:要求最大离心力在12 000 xg以上,5.2 PCR扩增仪,5. 3核酸电泳仪和水平电泳槽,5.4 恒温水浴锅,5.5 2℃.8℃冰箱和一18℃冰箱,5. 6 微量加样器(0. 5 .10 piL, 2 俨L.20 トレ 20 戸L.20。100 .1 000 ,5.7组 织研磨器或研钵,5.8凝 胶成像系统(或紫外透射仪),6样品的采集、运输和处理,6. 1样品采集和运输,宜采集腹泻急性期的小肠或新鲜粪便。采集小肠(5 cm.10 cm)或新鲜粪便(5 g.10 g),置于样品,密封袋中,在低温保存箱中送实验室,应确保样品到实验室时附带的冰袋未完全融化;如不能及时检测,应将样品置于低于ー18℃冰箱中保存,6.2样 品处理,6.2, I小肠样品,取1 cm-3 cm小肠组织,用剪刀剪碎,加入10 mL的PBS。用组织研磨器研磨后反复冻融3次,经,12 000 r/min离心5 min,取上清备用,6. 2.2粪便样品,取0. 5 g.1. 0 g新鲜粪便,加入800ル样品处理液。反复冻融3次,经12 000 r/min离心5 min,取,上清备用,6. 2.3细胞培养物样品,取细胞培养物300 ”..500kL无需任何处理,备用,7 RNA的提取,下列方法任选其ー。在提取RNA时,应设立阳性对照样品和阴性对照样品,按同样的方法提取,RNAO RNA的提取宜在无RNA污染的外排式生物安全柜中进行,a) Trizol法。按照生产厂家提供的操作说明进行,步骤如下:取250 HL上清作为待提取样品,加入750 Trizol,振荡混匀后,室温放置5 mmo加入氯仿250AL振荡混匀后,室温放置5,min.15 min,4℃ 12 000 r/min离心15 min〇取上层水相400(liL~500 juL,加入等体积的异丙,醇,混匀,一20℃放置2h以上或ー80℃放置0. 5 h,4℃ 12 000 r/min离心10 mm。去上清,缓,缓加入75%乙醇(用DEPC水配制)1.0mL洗涤,4℃ 12 00。r/min……
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